培养法、DNA荧光染色法、酶联免疫吸附法和PCR法，荧光定量PCR法，恒温荧光等。DNA荧光染色法是用Hoechst33342对细胞进行染色，荧光染色法检测支原体污染，利用 Hoechst 33342 可与双链 DNA 结合，在紫外光的激发下，释放强烈的蓝色荧光这一特点对细胞加以染色。经过染色，在荧光显微镜下，可见细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则荧光着色颗粒，为支原体污染细胞，此种方法容易出现假阳性，需要用PCR法进一步检测。通过支原体通用引物对细胞进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测, 通过比对分析扩增产物的大小, 可进行支原体感染的鉴定。